阪崎肠杆菌是一种危害严重的食源性病原菌，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达 50%以上。婴儿配方奶粉是阪崎肠杆菌污染的高危食品。我国 GB19644-2010 乳粉和 GB29921-2013 食品中致病菌限量都对乳及乳制品中阪崎肠杆菌的检测做出了规定。该标准物质可用于婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌检测方法评价和微生物实验室测量质量控制等。

一、 样品制备

选取阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）标准菌株（菌株编号 ATCC 25944），培养后与保护剂混合均匀，用移液器分装至西林瓶进行冻干。随后添加奶粉并压盖密封。

二、 溯源性及定值方法

本标准物质由多家单位采用阪崎肠杆菌涂布平板法（见附件 A）进行合作定值。通过对标准物质进行 10 倍系列稀释后，对可进行计数的培养基平板上的菌落数量进行计数，采用公式计算得到阪崎肠杆菌数量，其量值单位为 CFU/g（CFU，菌落形成单位 Colony-Forming Units）。通过使用满足计量学特性要求、经确认的定量测量方法和经检定校准的质量、容量等计量器具，确保本标准物质的量值溯源至实体数基本单位“一”（符号：1）以及国家法定计量单位克（g）。

三、 特性量值及不确定度

所赋特性量值的不确定度由定值方法、天平、移液器、稀释因子、均匀性和稳定性引入的不确定度分量合成得到。

四、 均匀性及稳定性评估

参照 JJF1343 国家计量技术规范（等效 ISO 指南 35），采用阪崎肠杆菌涂布平板法，按照随机抽样原则对样品进行均匀性评估，方差分析结果表明，样品均匀性良好；采用相同测量方法，按照先密后疏的原则对样品进行稳定性评估，趋势分析结果表明，-20℃下可以长期稳定保存，4℃下可以稳定保存 7 天。

该标准物质自定值之日起，有效期为 12 个月，研制单位将继续跟踪监测该标准物质的稳定性，有效期内如发现量值变化，将及时通知用户。

五、 包装、贮存及使用

1.包装与保存：本标准物质采用棕色西林瓶包装，-20℃避光保存。每瓶 0.50 g，计算时按照 0.50g 计算。采用干冰运输，收到后请于-20℃冰箱中保存。

2.使用：本标准物质开瓶后应当一次性完全使用。使用前从-20℃取出并在室温(20℃)下平衡 10分钟，用天平精确称量(4.49±0.01) g 无菌蒸馏水复溶冻干的标准物质。用户可参考附件 A 奶粉中阪崎肠杆菌计数标准物质测量方法，使用阪崎肠杆菌显色培养基进行测试。

3.本标准物质含有微生物，使用前应佩戴口罩和乳胶手套；使用时应注意防护，避免吸入或与皮肤接触；使用后的剩余样品、包装瓶及取样吸头等消耗品应按生物污染废弃物进行高压灭菌处置。

附件 A

奶粉中阪崎肠杆菌计数标准物质测量方法

本标准物质通过采用阪崎肠杆菌涂布平板法在阪崎肠杆菌显色培养基上完成标准物质测量。测量中使用的仪器设备需经计量校准；使用的阪崎肠杆菌显色培养基应符合 GB4789.28-2013 培养基和试剂的质量要求。

1. 标准物质的复溶与稀释：

标准物质从-20℃冰箱取出后，在 20℃±2℃平衡约 10 min，然后用天平称量(4.49±0.01) g 无菌蒸馏水复溶，充分混匀后制备成样品悬液。用无菌的磷酸盐缓冲液对样品悬液进行 10 倍系列稀释制备成不同稀释度悬液（1 mL 上一稀释度菌悬液加入 9 mL 无菌磷酸盐缓冲液进行稀释）。

2. 接种与培养：

选择三个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度吸取 0.2 mL 样品匀液分别加入三个阪崎肠杆菌显色培养基平板，然后用无菌 L 棒涂布整个平板。将平板倒置于培养箱，36℃±1℃培养 24 h±2 h，或按照该品牌阪崎肠杆菌显色培养基的说明进行培养。

3. 典型菌落计数和确证试验

阪崎肠杆菌在阪崎肠杆菌显色培养基平板上的典型菌落，按照该品牌的说明进行判定。选择有典型的阪崎肠杆菌菌落的平板，且单个平板的菌落数在 15 CFU~ 150CFU 之间的平板，计数典型菌落数，并从中选取 10 个特征菌落进行确证试验。

4. 结果计算

（1）若只有一个稀释度平板上的典型菌落数A在15 CFU~150 CFU之间，按公式（1）计算三个平板菌落数的平均值，再将平均值除以相应稀释因子计算，结果以活菌浓度（CFU/g）表示。

     公式（1）

式中，N为每g奶粉样品中的阪崎肠杆菌活菌数；Ai为某一稀释度某一平板上菌落数；Bi为该稀释度平板中鉴定为阪崎肠杆菌阳性的菌落数；Ci为该稀释度平板中用于鉴定试验的菌落数； m为某一稀释度平板个数；d为稀释因子。

（2）若在连续两个稀释度平板的典型菌落数A均在15 CFU~150 CFU之间时，按公式（2）计算。

       公式（2）

式中，N为每g奶粉样品中的阪崎肠杆菌活菌数；A1i为第一稀释度（低稀释倍数）适宜范围某一个平板上的典型菌落数；B1i为第一稀释度（低稀释倍数）适宜范围某一个平板上鉴定为阪崎肠杆菌阳性的菌落数；C1i为第一稀释度（低稀释倍数）适宜范围某一个平板上用于鉴定试验的菌落数；A2i为第二稀释度（高稀释倍数）适宜范围某一个平板上的典型菌落数；B2i为第二稀释度（高稀释倍数）适宜范围某一个平板上鉴定为阪崎肠杆菌阳性的菌落数；C2i为第二稀释度（高稀释度数）适宜范围某一个平板上用于鉴定试验的菌落数；；m为第一稀释度（低稀释度倍数）适宜范围平板个数；n为第二稀释度（高稀释度倍数）适宜范围平板个数；d为第一稀释度（低稀释倍数）的稀释因子。

（3）若所有稀释度平板的典型菌落数A均小于15 CFU，则计数最低稀释度平板上的典型菌落数A，按公式（1）计算。

（4）若所有稀释度平板的典型菌落数A均大于150 CFU，则计数最高稀释度平板上的典型菌落数A，按公式（1）计算。

（5）若某一稀释度平板的典型菌落数A大于150CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，则计数该稀释度平板上的典型菌落数A，按公式（1）计算。

（6）按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，将样品的阪崎肠杆菌数量记录为1.0~9.9乘以10的指数幂表示，单位为CFU/g。