金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起细菌性食物中毒的重要致病菌之一，也是引起奶牛乳房炎的主要因素之一，在乳及乳制品中有较高的检出率。本标准物质可用于乳及乳制品中金黄色葡萄球菌定量检测的方法验证和微生物实验室测量质量控制，也可以用于金黄色葡萄球菌选择性培养基的生长率评价，为评价结果的可靠性提供计量溯源保障。

一、 样品制备

选取金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）标准菌株（菌株编号 ATCC 6538P），培养后与保护剂混合均匀，用移液器分装至西林瓶进行冻干。随后添加奶粉并压盖密封。

二、 溯源性及定值方法

本标准物质由多家单位采用金黄色葡萄球菌涂布平板法（见附件 A）进行合作定值。通过对标准物质进行 10 倍系列稀释后，对可进行计数的培养基平板上的菌落数量进行计数，采用公式计算得到金黄色葡萄球菌数量，其量值单位为 CFU/g（CFU，菌落形成单位 Colony-Forming Units）。通过使用满足计量学特性要求、经确认的定量测量方法和经检定校准的质量、容量等计量器具，确保本标准物质的量值溯源至实体数基本单位“一”（符号：1）以及国家法定计量单位克（g）。

三、 特性量值及不确定度

所赋特性量值的不确定度由定值方法、天平、移液器、稀释因子、均匀性和稳定性引入的不确定度分量合成得到。

四、均匀性及稳定性评估

参照 JJF1343 国家计量技术规范（等效 ISO 指南 35），采用金黄色葡萄球菌涂布平板法，按照随机抽样原则对样品进行均匀性评估，方差分析结果表明，样品均匀性良好；采用相同测量方法，按照先密后疏的原则对样品进行稳定性评估，趋势分析结果表明，-20℃下可以长期稳定保存，4℃下可以稳定保存 7 天。

标准物质自定值之日起，有效期为 12 个月，研制单位将继续跟踪监测该标准物质的稳定性，有效期内如发现量值变化，将及时通知用户。

五、包装、贮存及使用

1.包装与保存：本标准物质采用棕色西林瓶包装，-20℃避光保存。每瓶 0.50 g，计算时按照 0.50g 计算。采用干冰运输，收到后请于-20℃冰箱中保存。

2.使用：本标准物质开瓶后应当一次性完全使用。使用前从-20℃取出并在室温(20℃)下平衡 10分钟，用天平精确称量(4.49±0.01) g 无菌蒸馏水复溶冻干的标准物质。用户可参考附件 A 奶粉中金黄色葡萄球菌计数标准物质测量方法，使用 Baird-Parker 培养基进行测试。

3.本标准物质含有微生物，使用前应佩戴口罩和乳胶手套；使用时应注意防护，避免吸入或与皮肤接触；使用后的剩余样品、包装瓶及取样吸头等消耗品应按生物污染废弃物进行高压灭菌处置。

六、参考文献
[1] GB 4789.10-2016, 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验[S].

附件 A

奶粉中金黄色葡萄球菌计数标准物质测量方法

本标准物质通过采用金黄色葡萄球菌涂布平板法在 Baird-Parker 培养基上完成标准物质测量。

测量中使用的仪器设备需经计量校准；使用的 Baird-Parker 培养基应符合 GB4789.28-2013 培养基和试剂的质量要求。

1. 标准物质的复溶与稀释：

标准物质从-20℃冰箱取出后，在 20℃±2℃平衡约 10min，然后用天平称量(4.49±0.01) g 无菌蒸馏水复溶，充分混匀后制备成样品悬液。用无菌的磷酸盐缓冲液对样品悬液进行 10 倍系列稀释制备成不同稀释度悬液（1 mL 上一稀释度菌悬液加入 9 mL 无菌磷酸盐缓冲液进行稀释）。

2. 接种与培养：

选择三个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量加入三块 Baird-Parker 平板，然后用无菌 L 棒涂布整个平板。将平板倒置于培养箱，36℃±1℃培养 24 h～48 h。

3. 典型菌落计数和确证试验

金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为 2 mm~ 3 mm，颜色呈黑色，有光泽，常有浅色（非白色）边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20CFU~200CFU 之间的平板，计数典型菌落数。然后从中选取 10 个特征菌落进行确证试验。

4. 结果计算

（1）按公式（1）计算某一稀释度平板上菌落数。

     公式（1）

式中，A为某一稀释度三个平板上金黄色葡萄球菌典型菌落的总数；n1、n2、n3分别为该稀释度的0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量的平板上金黄色葡萄球菌典型菌落数。

（2）若只有一个稀释度平板的典型菌落数A在20CFU~200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式（2）计算。

     公式（2）

式中，T为每g淀粉样品中的金黄色葡萄球菌活菌数；A为某一稀释度三个平板中金黄色葡萄球菌典型菌落的总数；B为该稀释度三个平板中鉴定为金黄色葡萄球菌阳性的菌落数；C为该稀释度三个平板中用于鉴定试验的菌落数；d为该稀释度的稀释因子。

（3）若2个连续稀释度平板的A值均在20CFU~200CFU之间，按式（3）计算。

    公式（3）

T为每g淀粉样品中的金黄色葡萄球菌活菌数；A1为第一稀释度（低稀释倍数）三个平板中典型菌落的总数；B1为第一稀释度（低稀释倍数）三个平板中鉴定为阳性的菌落数；C1为第一稀释度（低稀释倍数）三个平板中用于鉴定试验的菌落数；A2为第二稀释度（高稀释倍数）三个平板中典型菌落的总数；B2为第二稀释度（高稀释倍数）三个平板中鉴定为阳性的菌落数；C2为第二稀释度（高稀释度数）三个平板中用于鉴定试验的菌落数；d为第一稀释度（低稀释倍数）的稀释因子。

（4）若最低稀释度平板的典型菌落数A小于20CFU，则计数该稀释度平板上的典型菌落数A，按公式（2）计算。

（5）若某一稀释度平板的典型菌落数A大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，则需重新进行实验。

（6）若在连续两个稀释度平板典型菌落数A满足A2＜20＜200＜A1，则应按A1除以第一稀释度（低稀释倍数）的稀释因子d计算。

（7）按照GB/T 8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，将样品的金黄色葡萄球菌浓度记录为1.0~9.9乘以10的指数幂表示，单位为CFU/g。