转基因玉米 BT11 质粒分子标准物质可用于转基因玉米、食品和饲料等的定量检测、安全评价、实验室质量控制、方法评价与验证、技术仲裁等。
一、样品制备
本标准物质是将转基因玉米 BT11 转化体特异性序列和内标准基因片段共同构建于 pEASY-T3 载体[1]，得到 pNIM-002 质粒分子，经提取，纯化和质量检测及均匀性初检合格后稀释至 4.0×106 拷 贝/μL 进行分装。
二、溯源性及定值方法
该标准物质采用测序法、数字 PCR 方法分别对转基因玉米 BT11 转化体特异性基因片段和内标 准基因（zSSIIb）片断的拷贝数比值进行定值测量。测序法测量结果作为标准物质测序比值标准值； 数字PCR 方法测量结果作为标准物质 PCR 比值标准值。本系列标准物质通过使用满足计量学特性要求的制备方法、测量方法和计量器具，保证其量值溯源性。
三、特性量值及不确定度
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编号
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标准值及不确定度
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GBW10091
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测序比值
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扩展不确定度（k=2）
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PCR 比值
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扩展不确定度（k=2）
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1
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0.06
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0.98
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0.08
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标准值不确定度评定考虑了定值方法、均匀性、稳定性引入的不确定度分量。
四、均匀性和稳定性评估
参照 JJF1343 国家计量技术规范（等效 ISO 指南 35），采用实时荧光定量 PCR 方法对该标准物 质进行均匀性检验研究，最小取样量 5 μL，结果表明均匀性良好。按照先密后疏的原则采用实时荧 光定量 PCR 方法对该标准物质进行稳定性考察研究，标准值无方向性变化并通过平均值一致性检验，表明稳定性良好。
本标准物质自定值日期起，有效期为 7 年，研制单位将继续跟踪监测该标准物质的稳定性，有效期内如发现量值变化，将及时通知用户。
五、包装、储存及使用
1.包装与储存：本标准物质采用 2mL 立式拧口塑料离心管包装，500 μL/瓶。建议-70˚C 低温长期保存。
2.使用注意事项：使用前应先从冰箱内取出，平衡至室温后再打开瓶盖使用。样品开封后，应尽快恢复密封状态。
3.使用建议：使用本标准物质制作标准曲线时，按照表 1 进行梯度稀释，然后再采用荧光定量 PCR 进行检测，引物和探针序列[2, 3]详见表 2。
表 1 转基因玉米 BT11 质粒分子标准物质梯度稀释说明
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初始浓度(copy/μL)
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终浓度(copy/μL)
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转化体特异性基因检测 a
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内标准基因(zSSIIb)检测 b
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DNA 缓冲液(μL)
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质粒DNA(μL)
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稀释倍数
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4.0×106
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2.0×105
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E
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380
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20
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20
|
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2.0×105
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2.0×104
|
T
|
E
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180
|
20
|
10
|
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2.0×104
|
2.0×103
|
T
|
E
|
180
|
20
|
10
|
|
2.0×103
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4.0×102
|
T
|
|
200
|
50
|
5
|
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4.0×102
|
2.0×102
|
T
|
E
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100
|
100
|
2
|
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2.0×102
|
40
|
T
|
E
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80
|
20
|
5
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a T 表示用于测定转化体特异性基因时所需的质粒分子标准物质的稀释浓度
b E 表示用于测定内标准基因基因时所需的质粒分子标准物质的稀释浓度
表 2 外源基因和内标准基因的引物及探针序列
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基因名称
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引物或探针
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序列信息 (5’-3’)
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扩增片段长度/(碱基)
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BT11 外源基因
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上游引物
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5'-GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3'
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93
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下游引物
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5'-CAAGAAATGGTCTCCACCAAA-3'
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探针
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5'-FAM-TATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGA-TAMRA-3'
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内标准基因(zSSIIb)
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上游引物
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CTCCCAATCCTTTGACATCTGC
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151
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下游引物
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TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG
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探针
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FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA
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六、参考文献
[1] 董莲华、李亮、王晶 转基因玉米 pUC57-BT11 质粒标准分子的构建与适用性研究.计量学报, 2011，32（6）：1~5.
[2] Taverniers I, Windels P, Vaïtilingom M, Milcamps A, Van Bockstaele E, Van den Eede G, De Loose M. Event-specific plasmid standards and real-time PCR methods for transgenic Bt11, Bt176, and GA21 maize and transgenic GT73 canola. Journal of Agriculture Food Chemistry. 2005, 20;53(8):3041-52.
[3] Lee S., P.Y., Kim J., Park K., and Kim Y. Qualitative PCR method for detection of genetically modified maize lines NK603 and TC1507. Agriculture Chemistry Biotechnology, 2004. 47(4): p. 185~188.