CDKN2A/RARβ2/RASSF1A/SHOX2 基因启动子区域甲基化（5’-甲基胞嘧啶）质粒 DNA 标准物质可作为测量标准用于实时荧光定量 PCR、数字 PCR 方法和高通量测序定量测定 CDKN2A、RARβ2、RASSF1A 和 SHOX2 四种基因启动子区域甲基化，还可用于四种基因甲基化检测方法的验证和实验室质量控制等领域。

一、 样品制备

本标准物质是通过合成 CDKN2A（基因组坐标：1656-2201，GenBank：DQ406745.1）、RARβ2（基因组坐标：25428263-25428531，GenBank：NC_000003.12）、RASSF1A（基因组坐标：527-1081，GenBank ：DQ444319.1）和 SHOX2（基因组坐标：158103444-158103796，GenBank：NC_000003.12）。

四种基因启动子区域中富含 CG 位点的 CpG 岛序列构建在载体上。通过甲基化转移酶处理成完全甲基化的质粒后稀释至一定浓度分装作为高甲基化样本，将完全甲基化和完全未甲基化质粒按照一定质量比配制成三个不同甲基化比例后分装。

二、 溯源性及定值方法

采用经国际比对验证的克隆测序法和数字 PCR 方法对完全甲基化标准物质进行定值，采用重量法对不同甲基化比例标准物质进行定值。通过使用满足计量学特性要求、经确认的绝对定量测量方法和经检定校准的容量计量器具，确保本标准物质的量值溯源至可作为任何一个量制基本单位的实体数基本单位“一”（符号：1）以及体积和质量的国家法定计量单位升（L）和千克（kg）。

三、 特性量值及不确定度

注：*是重量法配制计算得到的甲基化丰度值；**是数字 PCR 法和克隆测序法测定得到的甲基化丰度值的平均值；

***是数字 PCR 多次直接测定后得到的甲基化序列拷贝数和非甲基化序列拷贝数的平均值。

所赋特性量值的不确定度由定值测量、均匀性和稳定性引入的不确定度分量合成得到。

四、 均匀性及稳定性评估

参照 JJF1343 国家计量技术规范（等效 ISO 33405），采用数字 PCR 方法对该标准物质进行均匀性检验，最小取样量为 5 μL，结果表明均匀性良好。按照先密后疏的原则采用数字 PCR 方法对该标准物质进行稳定性考察研究，标准值无方向性变化并通过平均值一致性检验，表明稳定性良好。

本标准物质定值日期起，有效期为 2 年，研制单位将继续跟踪监测该标准物质的稳定性，有效期内如发现量值变化，将及时通知用户。

五、 包装、及使用

1.包装规格：本标准物质采用 0.5 mL 冻存管包装，每管 30 μL，50 ng/μL。

2.保存和运输条件：置于-70°C 冰箱中保存，采用冰袋运输。

3.使用注意事项：使用前应先从冰箱内取出，平衡至室温后混匀使用，避免反复冻融。

4.空白试剂为甲基化水平为 0%的完全未甲基化质粒 DNA。